Стабильность рекомбинантных белков и РНК

Стабильность рекомбинантных белков и РНК * стабільнасць рэкамбінантных бялкоў і РНК * stability of recombinant proteins and RNA — уровень экспрессии рекомбинантных генов в реципиентных клетках определяется также стабильностью кодируемых этими генами мРНК и белков. Замены кодонов в мРНК дрожжей на синонимические не только приводят к снижению уровня трансляции измененных мРНК в клетках дрожжей, но и сопровождаются уменьшением стабильности самих мРНК. Требование стабильности мРНК является одним из факторов, определяющих давление отбора на использование конкретных синонимических кодонов для кодирования белков. Во внутриклеточной стабильности мРНК важную роль играют элементы ее вторичной структуры. Образование шпилек на 31-конце мРНК препятствует ее деградации под действием бактериальных эндонуклеаз, РНКазыII и полинуклеотидфосфорилазы. Поскольку изменение первичной структуры с учетом возможной вторичной структуры без изменения функциональных свойств представляется в н. вр. сложной задачей, проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных РНК решается, гл. обр., путем введения мутаций в гены экзо- и эндонуклеаз бактериальной клетки-хозяина. Т. н. безРНКазые штаммы E. coli находят применение в качестве реципиентов рекомбинантных плазмид в генной инженерии. При этом решается двойная задача: с одной стороны, в таких клетках повышается стабильность транскриптов рекомбинантных генов, а с др. пониженный внутриклеточный уровень определенных РНКаз способствует более эффективной очистке рекомбинантных белков, т. к. для многих ферментных препаратов даже незначительные примеси нуклеазной активности нежелательны. Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать чужеродные пептиды в клетках E. coli включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геном, кодирующим белок (напр., геном β-галактозидазы). Гибридный белок, образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена, содержит в своем составе в N- или C-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, напр., при получении рекомбинантного соматостатина, а также А- и В-цепей инсулина. Вторым подходом, позволяющим защищать рекомбинантные белки от внутриклеточного протеолиза, является выведение их в периплазматическое пространство или окружающую среду после завершения биосинтеза. При таком подходе рекомбинантные полипептиды соединяют сигнальными последовательностями аминокислот белков (β-лактамаза, OmpA, PhoA), секретируемых во внешнюю средуи периплазматическое пространство. Подобным путем были получены, напр., проинсулин, гормон роста человека и β-эндорфин.